Medizinische/ Biologische Chemie

Untersuchungen von Inhibitionsmechanismen kovalenter Inhibitoren

 

Aufgrund von vielfältigen Vorteilen erfahren kovalente Liganden zur Zeit eine Renaissance nicht nur in der Wissenschaft, sondern auch im industriellen Kontext.¹ Bezüglich ihrer Verwendung als Arzneistoffe sind sie in vivo effizienter und können in geringen Dosen und mit reduzierter Häufigkeit aufgrund verlängerter residence time am Target verabreicht werden.

Zusätzlich bietet das Konzept der kovalenten Modifikation von Proteinen weitere Möglichkeiten Targets zu adressieren, welche durch niedermolekulare Wirkstoffe als nicht adressierbar angenommen wurden, da spezifische Bindungstaschen nicht vorhanden waren („drug the undruggable“) ². Bisher jedoch wurden die meisten kovalenten Liganden zufällig gefunden, nicht nur weil Werkzeuge für die rationale Optimierung oder de novo Design nicht ausreichend etabliert und ausgearbietet wurden, in Relation zu den Methoden, welche beim Design nicht-kovalenter Liganden angewandt wird. Unsere Arbeitsgruppe untersucht und in Folge wendet Prinzipien und fundamentale Konzepte an, welche relevant für das rationale Design und für die Optimierung von kovalenten Protein Liganden sind. Viele Untersuchungen zielen auf die Aufklärung von Inhibitionsmechanismen kovalenter Inhibitoren^3,4 und die Rationalisierung bekannter Struktur-Aktivitäts-Beziehung ab. Zusätzlich, benchmarken wir die Genauigkeit vorhandener theoretischer Methoden zur Beschreibung der kovalenten Bindungsbildung.⁵

Das rationale Design kovalenter Inhibitoren von Grund auf ist praktisch unmöglich, weil Informationen über die geometrische Struktur des adressierten Enzyms essentiell sind. Zusätzlich sind theoretische Methoden zur Vorhersage von Enzym-Inhibitoren Komplexen meist sehr ungenau. Deshalb sollten Struktur-basierte Protokolle weniger fehleranfällig als Ansätze ohne strukturelle Informationen.

 

 

Abbildung 1: Mögliche Startstrukturen des Protokolls zum rationalen Design kovalenter Inhibitoren mit gewünschten Eigenschaften

 

Die Situation ist in Abbildung 1 dargestellt, in der mögliche Startpunkte zur Entwicklung von kovalenten Inhibitoren mit gewünschten Eigenschaften gezeigt werden. Um z.B. selektive irreversible Inhibitoren zu erhalten, kann man mit vorhandenen kristallographischen Daten von bekannten unselektiven irreversiblen Inhibitoren starten.⁶ Ein weiterer Startpunkt zur Entwicklung von kovalenten Inhibitoren sind kristallographische Daten von reversiblen nicht-kovalenten Inhibitoren. Das Prinzip wurde von anderen Gruppen angewandt, um kovalente Kinase Inhibitoren ausgehend von nicht-kovalenten zu entwickeln (Abbildung 2).

 

 

Abbildung 2: Entwicklung von kovalenten Kinase Inhibitoren ausgehend von nicht-kovalenten Verbindungen

 

Kovalenten Inhibitoren können in Verbindungen unterteilt werden, welche aktivierte Reste in der aktiven Tasche von Enzymen (orthosterische Inhibition) modulieren und Molekülen, welche in der Lage sind mit nicht-aktivierten Resten außerhalb der aktiven Tasche zu reagieren. Letztere können das Enzym inhibieren, da sie den Eingang der aktiven Tasche blockieren oder die Enzym Katalyse allosterisch deaktivieren. Im ersten Fall kann sich eine geringere Selektivität zeigen, weil die Region der aktiven Tasche konservierter ist.^7,8 Im anderen Fall kann es komplizierter sein, weil man Einheiten hinzufügen muss, welche die Reste aktivieren. ASS scheint in diesem Fall ein Beispiel zu sein.^9,10

 

Untersuchung von orthosterischen Inhibitoren

 

Est kürzlich konnten wir in Kollaboration mit  Schirmeister aus Mainz ein Protokoll zum rationalen Design reversibler Inhibitoren ausgehend von irreversiblen entwickeln (Abbildung 3).¹¹ Das Protokoll The protocol umfasst verschiedene computer-gestützte Schritte, welche nah an den dazugehörigen Experimenten verbunden sind, die die Vorhersagen realisieren und verifizieren. Als Startpunkt wurden die Untersuchungen  an K11777 durchgeführt, ein allgemein bekannter irreversibler Inhibitor von Rhodesain. K11777 enhtält eine Vinylsulfon-Gruppe als elektrophilen Warhead, welcher irreversibel mit dem CYS25 Rest der aktiven Tasche von Rhodesain reagiert. Innerhalb dieser Untersuchungen haben wir zwei mögliche Modifikationen des Warheads entwickelt.¹¹Während sich der erste als ungeeignet zeigt, ¹² konnte durch Substitution eines Wasserstoffs der Doppelbindung durch ein Halogenatom die Thermodynamik der Reaktion in gewünschte Richtung geändert werden. In beiden Fällen zeigten sich die berechneten Vorhersagen als korret, das heißt der angewandte Ansatz scheint ausreichend genau zu sein. Das Protokoll umfasst Standard quantenchemische Ansätze um mögliche Warheads zu screenen. Hybrid-Ansätze, welche eine Kombination aus quantenmechanischen (QM) Methoden, die chemische Reaktionen beschreiben, und molekular mechanische (MM) Methoden, welche den Einfluss der Enzymumgebung beschreiben, wurden angewandt um die Inhibitionsreaktion innerhalb des Enzyms zu berechnen. Die Berechnungen starteten von kristallographischen Daten des kovalenten Enzym-Inhibitor Komplexes von K11777 und Rhodesain und der Pfad der Rückreaktion zum nicht-kovalenten Komplex wurden berechnet. Für weitere Informationen empfehlen wir einen Blick auf die Literatur^11,12 In diesen Untersuchungen hat die Gruppe von Prof. Schirmeister  (Mainz) jede Syntehese durchgeführt und sowohl in Lösung als auch im Enzym getestet. Zusätzlich haben sie bei den Docking Untersuchungen beigetragen. Weitere wichtige Beiträge kamen von der Gruppe Prof. Hellmich (Mainz), die die Enzym-Inhibitor Komplexe durch 19 F NMR Spektroskopie analysiert haben und  Prof Tenzer (Mainz) , der durch Massenspektrometrie  Messungen beigetragen hat, den Nachweis der kovalenten Bindungsbildung zu bringen.

 

  

Abbildung 3: Protokoll zur Entwicklung reversibler kovalenter Inhibitoren unter Anwendung von bekannten irreversiblen als Startpunkt

 

Ebenfalls in enger Zusammenarbeit mit Prof. Schirmeister (Mainz) haben wir Struktur-Aktivitätsbeziehung (z.B. Regio- und Stereoselektivität) von Inhibitoren untersucht, deren Elektrophilie aufgrund von 3-gliedrigen Ringen oder Michael Systemen resulteiren.^4,13,14 In einer derzeitigen Arbeit untersuchen wir Inhibitionsmechanismen von Verbindungen, welche Nitro-Alkene als Warheads tragen. Diese sind wesentlich potenten als Vinylsulfon-basierte Inhibitoren und scheinen verschiedene Inhibitonsmechanismen zu haben.,¹⁵ Derzeit werden auch Chloro- oder NItril-substituierte 1,4-Naphtoquinone als Warheads in Kooperation mit Prof. Opatz (Mainz) and  Prof. Schirmeister (Mainz) untersucht, welche in Form einer Michael-Addition und/oder Substitution reagieren.

 

Abbildung 4: links: Berechneter nicht-kovalenter Komplex von Carbamat-basiertem Warhead und Cathepsin B. rechts: Computed non-covalent complex of the carbamate-based warhead and cathepsin B. right hand side: Potentialhyperfläche des Zwischenschrittes

In Zusammenarbeit mit Prof. Gütschow (Bonn) haben wir die Inhibitionsreaktion von Carbamat-basierten Komponenten in Cathepsin B untersucht. Der zugrundeliegende Mechanismus scheint komplizierter zu sein als oben diskutierte Additionen an aktivierten Doppelbindungen, weil die Reaktion aus mehreren Schritten besteht, welche häufig den Prozess des Protonontransfers beinhaltet. In derzeitigen Untersuchungen vergleichen wir verschiedene Reaktionswege, um diesen komplizierten Sachverhalt zu erklären.

 

 

Abbildung 5: K11777 (links) und sein Derivat 7a (rechts)

 

Für K11777 und seinem Derivat 7a (Abbildung 5) haben wir Untersuchungen durchgeführt, ob gemessene Trends der k_inact Werte zur Inhibition von Rhodesain¹⁶ mittels der Theorie erklärt werden kann (k_inact (K11777) = 0.029 s^-1; k_inact (7a) = 0.00051 s^-1). Die berechneten Reaktionsprofile der kovalenten Bindungsbildung zeigten keine Unterschiede wie im Fall der Untersuchung der Stereoselektivität von der Inhibition des Cathepsin B durch E64C verwandte Strukturen.^13,17 Im Gegensatz dazu zeigen MD Simulationen, dass die Unterschiede aufgrund der geometrischen Orientierung des nicht-kovaleten Komplexes liegen. Diese sagen für K11777 eine deutlich geringere Distanz zwischen elektrophilem Zentrum des Warheads und Cys25 aus als für 7a, bei dem größere Distanzen gefunden wurden. In Kooperation mit  Prof. Hellmich (Mainz), Prof. Schindelin (Würzburg), aundProf. Ochsenfeld (LMU Munich) haben wir den Bindungsmechanismus von kovalenten Inhibitoren von Tryparedoxin (Tpx) von T. brucei untersucht.

 

Reaktion kovalenter Inhibitoren mit nicht-aktivierten Resten

In Kooperation mit dem Arbeitskreis von  Prof. Seibel (Würzburg) haben wir die kovalente Modulation von Tyr196 und Tyr247 in levansucrase vom Bacillus megaterium (Bm-LS) der glycoside hydrolase Familie GH68¹⁸ durch by 4-phenyl-3H-1,2,4-triazole-3,5(4H)-dione (II Abbildung 6) untersucht.^19-21 In Zusammenarbeit mit Prof. D. Rauh wurden Reaktionen von Cys296 und Cys310 der Proteinkinase AKT durch verschiedene kovalente Inhibitoren untersucht.

 

 

Abbildung 6: links: TAD (I), das berechnete Produkt von TAD und Cresol (Ia), und links: mögilche Intermediate der berechneten Reaktionspfade

 

4-Phenyl-1,2,4-triazolin-3,5-dione (PTAD) und seine Derivate sind starke elektrophile Modifikations Reagenzien, welche in einer Ene-Reaktion mit Tyrosin Resten reagieren könnnen, wie von Barbas III et al.gezeit.^19-21 Um Einblicke in den Reaktionsmechanismus von PTAD und ähnlichen Strukturen zu erhalten, haben wir unsere Untersuchungen mit der Reaktions von TAD begonnen, da diese schon in der Literatur vorhanden war. Gemäß Barbas III et al verläuft die Reaktion von PTAD an der Tyrosin-Seitenkette mittels einem konzertierten Übergangszustand des Ene-Mechanismus.²¹ Theoretische Untersuchungen von Houk und Kollegen²² deuten darauf hin, dass die entsprechende Reaktion zwischen Propen und TAD mittels einer schrittweisen als einer konzertierten Reaktion stattfindet. Wir haben die REaktion mit Propen, Vinylalkohol und Para-Cresol berechnet, um Unterschiede zu untersuchen. Für die Berechnungen haben wir CASPT2 verwendet, um Intermediate der konzertierten oder schrittweisen Reaktion mit der gleichen Genauigkeit zu beschreiben. Unsere Berechnungen unterstützen die Ergebnisse von Houk und Kollegen für die Reaktion von TAD mit Propen, konten aber auch zeigen, dass die REaktion von Vinylalkohol und Para-Cresol mittels einem konzertierten Mechanismus verlaufen (Abbildung 6), das heißt unsere Berechnungen unterstützen auch die Interpretationen von Barbas und Kollegen. Die Untersuchungen wurden in Kollaboration mit  Prof. Seibel durchgefüht.

Die Proteinkinase AKT repräsentiert ein wichtiges neues Target für eine Reihe von Tumoren²³. Das Rauh lab (Dortmund), welches verschiedene kovalente allosterische Inhibitoren für AKT entwickelt24, konnte zeigen, dass Strukturen, welche Acrylamid Warheads an unterschiedlichen Positionen besitzen, meistens mit Cys296 oder Cys310 von AKT reagieren. Um die Gründe der Regioselektivität genauer zu beleuchten, haben wir MD SImulationen der entsprechenden nicht-kovalenten Enzym-Inhibitore Komplexe durchgeführt. Sie konnten in der Tat zeigen, dass die Regioselektivität  aufgrund der Variationen der Distanzen zwischen elektrophilem Zentrum des Warheads und der entsprechenden Cysteine Seitenkette liegen. Wir haben auch Gründe für die Aktivierung von Cys296 und Cys310 untersucht. DIe Simulationen deuten darauf hin, dass Cys296 meist durch Glu85 deprotoniert werden kann, da die berechneten Distanzen zu Arg76 zu hoch sind. Für Cys310 scheinen Arg15 und Glu298 eine Rolle in der Aktivierung zu spielen. In einer weiteren derzeitig durchgeführten Arbeit, welche in Kooperation mit  Prof. Holzgrabe (Würzburg), Prof. Sotriffer (Würzburg), und Prof. Kisker (Würzburg) durchgeführt wird, versuchen wir ein Computer-basiertes Protokoll zu erstellen, welches kovalente Inhibitoren für nicht-aktivierte Tyr147 oder Ser197 Seitenketten in Enoyl-.Acyl Carrier Protein Reduktase (FabI) designed, ausgehend von bekannten nicht-kovalenten Inhibitoren.²⁵

 

Untersuchung von Inhibitionsmechanismen nicht-kovalenter Inhibitoren

In Kooperation mit  Prof. Kisker und Prof. Sotriffer haben wir nicht-kovalente Inhibitoren für InhA und FabI untersucht. Die kristallographischen Daten des Inhibitors 55JS in FabI sowie in InhA deuten darauf hin, dass 55JS in InhA in der hydroxypyrimidin Form vorliegen, während die tautomere Form des Pyridons in FabI vorherrscht. Wir konnten diese Annahme durch MD Simulationen unterstützen. Um die verschiedenen Effekte zu differenzieren, haben wir die Energiedifferenz zwischen beiden tautomeren Formen mittels quantenmechanischen Ansätzen berechnet. Unsere Berechnungen deuten darauf hin, dass der Diphenylether Substituent und die Umgebung die relative Energie zwischen beiden tautomeren Form unterschiedlich beeinflusst. Ohne Substituent ist die Hydroxypyrimidin Form in Vakuum stabiler, jedoch führen Sovlenseffekte dazu, dass die Pyridon Form stabiler ist. Im Gegensatz dazu zeigt Inhibitor 55JS, dass das Pyridon Tautomer sowohl in Vakuum als auch im implizitem Solvens stabiler ist.

 

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